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干货|微生物检测中培养基的质量控制措施!

放大字体  缩小字体 发布日期:2020-05-27  浏览次数:106
核心提示:培养基是液体、半固体或固体形式的,含天然或合成成分,用于保证微生物繁殖或保持其活力的物质。培养基的制备和使用是微生物实验
培养基是液体、半固体或固体形式的,含天然或合成成分,用于保证微生物繁殖或保持其活力的物质。培养基的制备和使用是微生物实验室检测工作的重要环节,培养基自身质量的优劣、保存是否得当、配制使用是否正确等都直接影响到检测结果的准确性。本文对微生物实验室在培养基购置、贮存、制备、使用等方面应采取的质量控制措施进行讨论,谈一些观点和看法。希望有助于微生物检测工作的同行们更好的开展工作。

培养基的购置与验收

1.1 购置

从培养基自身的质量来看,不同生产厂家的产品,甚至同一厂家不同批号的产品都会存在差异。依据ISO/IEC17025《检测和校准实验室能力的通用要求》,对培养基的供应企业进行评价后选择合格的供应商,这是培养基购买过程中重要的步骤。应选择产品市场信誉度高、有质量保证能力和服务保证能力的企业;企业是否通过了质量管理体系的认证是较为客观的评价指标。


要求生产企业提供:培养基成分名称及产品编号、批号、使用前的pH、储藏信息和有效期、性能评价和所用测试菌株、技术数据清单、质控证书以及必要的安全/危害数据等材料。


1.2 验收

购买的培养基到货后,应有专人做好接受和验收工作,应仔细核对生产企业提供的资料、培养基名称、规格数量、外观特征、批号、保质期是否符合要求。每批培养基到货后都应对培养基的质量进行检测,满足检测方法规定的要求后方可投入使用。


培养基的储存

干粉培养基应保存在阴凉干燥处,要避免阳光直射;未开瓶的培养基在室温下的保存期限以厂家提供为准,开瓶后的干粉培养基易吸湿,应注意防潮并尽快用完。


 

应定期对储存中的培养基进行常规检查,如容器密闭性复查、首次开封日期、内容物的感官检查,如果培养基发生结块、颜色异常和其他变质迹象就不能再使用。


培养基的制备

3.1 培养基用水

培养基制备用水应使用电阻率不小于30万Ωcm的蒸馏水或与其同质的水,最好不使用离子交换器生产的去离子水。


3.2 称量

称量时要用专用的角匙,避免交叉污染而影响检验结果;干粉培养基易吸潮,如有条件,尽量在湿度较低的房间称取培养基。


3.3 复水

复水时不得用铜锅或铁锅,以防有离子混入培养基中,影响微生物的生长;容器的大小需大于复水后培养基总体积的2倍以上,避免在加热溶解过程中,培养基溢出;含有琼脂粉的培养基,在加热溶解之前可以浸泡数分钟;加热培养基时一定要进行搅拌,特别是琼脂类培养基。为避免烧焦和沸腾溢出,对于少量的培养基最好使用沸水浴进行加热。


烧糊的培养基营养物质被破坏,并可产生有毒物质,如发现焦化,或未溶解均匀前培养基有溢出,该培养基即不能使用,应重新制备。对于琼脂类培养基进行再融化时应使用沸水浴或流动蒸汽进行加热,最多只能加热两次,第二次再融化后仍未用完的培养基应弃去。


3.4 灭菌

一般培养基采用湿热灭菌,即高压蒸汽灭菌,通常是121℃ 15 min,含糖或特殊培养基,按照国家标准或生产商提供的说明灭菌。已配制好的培养基必须立即灭菌,避免微生物生长繁殖而消耗养分,改变培养基的酸碱度。


高温可破坏培养基的营养成分,还会使琼脂的凝胶强度下降,因此必须严格控制灭菌温度和时间,并且不可重复灭菌。高压蒸汽灭菌锅的压力表等要定期进行检定,并定期采用生物指示菌法或化学变色纸片对灭菌效果进行验证。


3.5 pH测定

微生物必须在适宜的pH范围内才能正常生长繁殖或体现其生物特性。培养基配方要求的pH为灭菌或消毒后的pH值,即培养基使用前的pH,并应在25℃温度下采用精密酸度计进行测量,固体琼脂培养基应以特殊的胶体表面测量电极进行测量。使用过程中,如果需要调整培养基的pH,应用1mol/L Na0H或 lmol/LHCL调整,注意不可反复调pH,否则会影响培养基的渗透压。


3.6 配制好的培养基保存

灭菌以后培养基应该迅速冷却至所需温度,避免长时间保存在灭菌锅内,造成过度灭菌,影响培养基的营养成分或选择性效果。


所配制的培养基的量,应该是在最长保存期限内正好使用完。含染料的培养基应闭光保存;倒好的琼脂平板如果配制的当天未使用完,应于冷藏保存,如果保存时间超过2天,应将其放入密封的塑料袋中保存;配好的肉汤类培养基如果保存时间超过2个星期,应将其放在带有螺旋盖的试管或其它密闭的试管或容器中防止蒸发。


培养基的性能测试

4.1 外观控制

制备好的培养基应有相应的颜色,一般的培养基应澄清、无浑浊、无沉淀。使用前应检查培养基的颜色是否发生变化,是否蒸发/脱水。


4.2 污染控制

从每批制备好的培养基中选取部分进行污染测试(空白试验),确定无微生物生长方可使用。


4.3 性能测试

4.3.1 测试菌株选择: 测试菌株是具有其代表种的稳定特性并能有效证明实验室特定培养基最佳性能的一套菌株,应来自国际/国家标准菌种保藏中心ATCC标准菌株或其他有证书的菌株。


4.3.2 定量测试方法: 改良Miles-Misra法。测试菌株过夜培养物10倍递增稀释;测试平板和参照平板划分为4个区域并标记;从最高稀释度开始,分别滴一滴稀释液于试验平板和对照平板标记好的区域;将稀释液涂满整个1/4区域,37°C培养18小时;对易计数的区域计数,按公式计算生长率(生长率=待测培养基平板上得到的菌落总数/参考培养基平板上获得的菌落总数)。非选择性培养基上目标菌的生长率应不低于0.7,该类培养基应易于目标菌生长;选择性培养基上目标菌的生长率应不低于0.1 。


4.3.3 半定量测试方法:改进的划线法接种法。 平板分ABCD四区,共划16条线,平行线大概相隔0.5cm,每条有菌落生长的划线记作1分,每个仅一半的线有菌落生长记作0.5分,没有菌落生长或生长量少于划线的一半记作0分,分数加起来得到生长指数G。目标菌在培养基上应呈现典型的生长,而非目标菌的生长应部分或完全被抑制,目标菌的生长指数G大于6时,培养基可接受 。


4.3.4 定性测试方法 :平板接种观察法。 用接种环取测试菌培养物,在测试培养基表面划平行直线。按标准中规定的培养时间和温度对接种后的平板进行培养,目标菌应呈现良好生长,并有典型的菌落外观、大小和形态,非目标菌应是微弱生长或无生长 。


 

另外对选择性培养基还应选择被抑制生长的菌株进行培养基验收。


附件:教你看懂培养基检验报告单(CoA)

干粉类培养基的检验报告单主要包括以下内容,建议拿一份CoA结合本文阅读。

1. 感官

一般包括色泽、气味、形态、杂质等,属于主观评价。不同厂家产品会有不同。


2.  理化

a) 干燥失重或水分

一般控制在5%-6%以内,不同厂家会有不同。结合水活度来说,这是控制培养基干粉微生物污染的重要手段。同时要关注密封情况,不能破坏水活度的环境。


b)  凝胶强度

这条仅限于是琼脂类干粉培养基,一般描述为适宜或适中。因为琼脂平板一般要倒置培养,所以凝胶强度非常重要。而凝胶强度的高低也直接来源于琼脂的质量。琼脂是一种来源于海藻中,具有自然变异性的生物材料,并不是营养物质。主要应用于食品和制药行业,食品行业使用量最大,如果冻。细菌学琼脂主要从石花菜中获取,而目前全球正经历石花菜的短缺。


琼脂质量也用凝胶强度来评价。琼脂类培养基必须达到规定的凝胶强度才能实现稳定倒置培养。如果加入的琼脂本身的凝胶强度小,加入量就要增加。过多的加入琼脂量不仅造成不必要的浪费而且会造成培养基过硬,直接影响微生物对营养物质的吸收利用,而且培养基过硬时平板划线容易产生裂痕,所以有时候并不是你的技术问题。从这个角度来说就很好理解为什么国外的一些标准中培养基的琼脂用量是一个范围,如每升培养基的琼脂含量为12-20g,其实是根据所用琼脂的凝胶强度不同来决定的。凝胶强度可以用凝胶强度测定仪直接检测。

 

c)澄清度

溶解之后的澄清度情况,液体培养基尤其要关注这点。 


d)pH值

灭菌后在25℃的pH测定值。琼脂类培养基必须采用平头pH值测定仪测定。

 

3. 微生物

 a)回收率

接菌量在10-100cfu/ml,回收率标准同药典标准。但是要注意对照培养基不一定是药典用的中检院推广的对照培养基。有些国外生产培养基的对照培养基只是前一批次合格产品。


b)质控菌

菌落特征要符合标准,菌落颜色、大小、其他特征。生长情况描述为良好或者用+++表示。将质控菌稀释到一定浓度后,使用定量接种环进行四区划线后看结果,第四区能出现单个菌落并形态明显最好。那+++是不是只代表只生长到第三区呢?你可以问问你的培养基供应商。


c)抑菌情况

分为部分抑制,完全抑制。也是用四区划线法,一般部分抑制允许在第一区有部分菌落存在。但是接菌量有区别,有些是100-1000cfu/ml有些是1000-10000cfu/ml,要注意不同厂家的产品上会有说明。单从抑菌情况来说,如果接菌量越大抑制情况都可以达到越好,但是要结合生长情况考虑,很多抑菌成分如果过多也会对正常生长的菌产生影响。


如何评价一份高质量的CoA?

1.  结果有具体数字,如水分或干燥失重、pH、回收率、凝胶强度等。


2. 在同样的培养条件下生长情况能达到四区划线都有。


3.  抑制情况是该抑制的都抑制。


4.有配套的MSDS,化学品安全技术说明书。

一般的MSDS应该包括组分信息、急救措施、消防措施、泄漏应急处理、操作处置与储存、接触控制和个体防护、理化特性、稳定性、毒理学信息、生态学信息、废弃处置等。

从安全操作的角度来说,MSDS告诉你保护自己和保护环境的有用信息。

从稳定操作角度来说,MSDS告诉你一瓶开盖干粉培养基可以放置多久。

从废物处理角度来说,MSDS告诉你大量干粉应该如何处置。

编辑:songjiajie2010

 
 
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